Кількість
|
Вартість
|
||
|
Молекулярно-генетичні методи дослідження
Компанія Укрвет проводить молекулярно-генетичні дослідження наступними методами:
- Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR).
- Секвенування ДНК.
- Філогенетичний аналіз.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах (реплікації), за допомогою ПЛР ампліфікують відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ.
Для проведення ПЛР в найпростішому випадку потрібні такі компоненти:
- ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати.
- Праймери - короткі синтетичні олігонуклеотиди довжиною 18-30 підстав, комплементарні на протилежних кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
- Термостабільна ДНК-полімераза - фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
- Дезоксирибонуклеозидтрифосфатів (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
- Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції.
- Реакція проводиться в 30-50 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій: денатурація, віджиг, елонгація.
ПЛР в режимі реального часу (real-time PCR):
Real-time PCR це група методик, що дають можливість аналізу продуктів ПЛР в режимі реального часу по ходу проведення реакції.
Основними етапами даного методу є:
- Визначення виходу продукту реакції після кожного циклу ампліфікації.
- Побудова за цими даними кінетичної кривої PCR.
Визначення відносної концентрації субстрату на підставі аналізу цієї кривої:
Для детекції PCR-продукту використовуються флуоресцентні барвники, що забезпечують флуоресценцію, прямо пропорційну кількості ПЛР-продукту. Механізми її генерації розрізняються залежно від конкретного типу real-time PCR.
Кінетична крива PCR має S-подібну форму.
В ній можна виділити три стадії:
- Стадію ініціації (коли PCR-продукти ще не детектуються флуоресцентною міткою).
- Експонентну стадію (в якій спостерігається експоненціальна залежність кількості флуоресценції від циклу PCR).
- Плато (стадію насичення).
Початкова кількість субстрату визначається порогом циклу (threshold cycle), такий цикл n, на якому досягається певний заданий рівень флуоресценції - порогова флуоресценція за умови, що ефективність реакції і заданий рівень порогової флуоресценції однакові для кожної з порівнюваних реакцій.
Варіанти real-time PCR розрізняються за способами генерації флуоресценції. Два основних використовуваних в даний час способи - це:
- Застосування інтерколіруючіх флуоресцентних агентів, флуоресценція яких значно зростає при зв'язуванні з дволанцюговою ДНК,
- Використання мічених флуоресцентними агентами олігонуклеотидних проб, комплементарних області PCR-продукту.
Переваги методу ПЛР, як методу діагностики інфекційних захворювань:
- Виявлення ДНК збудника методом ПЛР дає пряму вказівку на присутність збудника інфекції.
- Висока специфічність методу ПЛР обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється унікальний, характерний тільки для даного збудника фрагмент ДНК, виключає можливість отримання помилкових результатів, на відміну від методу імуноферментного аналізу, де часті помилки в зв'язку з перехресно-реагуючими антигенами.
- Метод ПЛР, завдяки високій чутливості, дозволяє виявляти навіть поодинокі клітини бактерій або вірусів. Чутливість ПЛР-аналізу складає 10-1000 клітин в пробі (чутливість імунологічних і мікроскопічних тестів - 103-105 клітин).
- Універсальність процедури виявлення різних збудників полягає в тому, що матеріалом для дослідження методом ПЛР слугує ДНК або РНК збудника. Подібність хімічного складу всіх нуклеїнових кислот дозволяє застосовувати уніфіковані методи проведення лабораторних досліджень. Це дає можливість діагностувати кілька збудників з однієї біопроби.
- Висока швидкість отримання результату аналізу обумовлена тим, що для проведення ПЛР-аналізу не потрібно виділення і вирощування культури збудника, що займає велику кількість часу.
Секвенування
Секвенування, секвенс (від англ. Sequence - послідовність) - визначення первинної амінокислотної або нуклеотидної послідовності біополімерів (білків і нуклеїнових кислот - ДНК і РНК). В результаті виходить лінійний символьний опис, який коротко пояснює структуру молекули. Для секвенування в даний час зазвичай застосовується метод Сенгера з дідезоксінуклеозідтріфосфатамі (ddNTP). Зазвичай до початку секвенування за допомогою ПЛР проводять ампліфікації ділянки ДНК, послідовність якої потрібно визначити.
Філогенетичний аналіз
Аналіз молекулярних даних є одним з підходів до теоретичного вивчення структури і функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) і їх еволюційного перетворення. Основна мета філогенетичного аналізу - вивчення еволюційного порядку дивергенції послідовностей генів і білків або їх частин, а також відновлення списків еволюційних подій (замін нуклеотидів, делецій і вставок) в предкових лініях цих макромолекул.
Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких за структурою або по функції генів або білків, і перш за все, порівняння їх первинних послідовностей. Найважливішою властивістю функціонально значущих структур макромолекул є їх еволюційний консерватизм. Чим менше функціональна важливість окремих ділянок генів, тим більше вони мають тенденцію до еволюційної мінливості.