0Порівняння товарів
Графік роботи:

Пн.– Пт.: 09:00–18:00
Сб.– Нд.: онлайн замовлення

0
Мій кошик

Молекулярно-генетичні методи досліджень

Артикул: 0214-0245

Молекулярно-генетичні методи дослідження

Компанія Укрвет проводить молекулярно-генетичні дослідження наступними методами:

  • Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР, PCR).
  • Секвенування ДНК.
  • Філогенетичний аналіз.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)

Метод заснований на багаторазовому вибірковому копіюванні певної ділянки ДНК за допомогою ферментів в штучних умовах (in vitro). При цьому відбувається копіювання тільки тієї ділянки, яка задовольняє заданим умовам, і тільки в тому випадку, якщо вона присутня в досліджуваному зразку. На відміну від ампліфікації ДНК в живих організмах (реплікації), за допомогою ПЛР ампліфікують відносно короткі ділянки ДНК. У звичайному ПЛР-процесі довжина копійованих ДНК-ділянок становить не більше 3000 пар основ.

Для проведення ПЛР в найпростішому випадку потрібні такі компоненти:

  • ДНК-матриця, що містить ту ділянку ДНК, яку потрібно ампліфікувати.
  • Праймери - короткі синтетичні олігонуклеотиди довжиною 18-30 підстав, комплементарні на протилежних кінцях різних ланцюгів необхідного фрагмента ДНК.
  • Термостабільна ДНК-полімераза - фермент, який каталізує реакцію полімеризації ДНК. Полімераза для використання в ПЛР повинна зберігати активність при високій температурі тривалий час, тому використовують ферменти, виділені з термофілів - Thermus aquaticus (Taq-полімераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полімераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полімераза) та інші.
  • Дезоксирибонуклеозидтрифосфатів (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
  • Буферний розчин, що забезпечує необхідні умови реакції.
  • Реакція проводиться в 30-50 циклів, кожен з яких складається з трьох стадій: денатурація, віджиг, елонгація.

ПЛР в режимі реального часу (real-time PCR):

Real-time PCR це група методик, що дають можливість аналізу продуктів ПЛР в режимі реального часу по ходу проведення реакції.

Основними етапами даного методу є:

  • Визначення виходу продукту реакції після кожного циклу ампліфікації.
  • Побудова за цими даними кінетичної кривої PCR.

Визначення відносної концентрації субстрату на підставі аналізу цієї кривої:

Для детекції PCR-продукту використовуються флуоресцентні барвники, що забезпечують флуоресценцію, прямо пропорційну кількості ПЛР-продукту. Механізми її генерації розрізняються залежно від конкретного типу real-time PCR.

Кінетична крива PCR має S-подібну форму.

В ній можна виділити три стадії:

  • Стадію ініціації (коли PCR-продукти ще не детектуються флуоресцентною міткою).
  • Експонентну стадію (в якій спостерігається експоненціальна залежність кількості флуоресценції від циклу PCR).
  • Плато (стадію насичення).

Початкова кількість субстрату визначається порогом циклу (threshold cycle), такий цикл n, на якому досягається певний заданий рівень флуоресценції - порогова флуоресценція за умови, що ефективність реакції і заданий рівень порогової флуоресценції однакові для кожної з порівнюваних реакцій.

Варіанти real-time PCR розрізняються за способами генерації флуоресценції. Два основних використовуваних в даний час способи - це:

  • Застосування інтерколіруючіх флуоресцентних агентів, флуоресценція яких значно зростає при зв'язуванні з дволанцюговою ДНК,
  • Використання мічених флуоресцентними агентами олігонуклеотидних проб, комплементарних області PCR-продукту.

Переваги методу ПЛР, як методу діагностики інфекційних захворювань:

  • Виявлення ДНК збудника методом ПЛР дає пряму вказівку на присутність збудника інфекції.
  • Висока специфічність методу ПЛР обумовлена тим, що в досліджуваному матеріалі виявляється унікальний, характерний тільки для даного збудника фрагмент ДНК, виключає можливість отримання помилкових результатів, на відміну від методу імуноферментного аналізу, де часті помилки в зв'язку з перехресно-реагуючими антигенами.
  • Метод ПЛР, завдяки високій чутливості, дозволяє виявляти навіть поодинокі клітини бактерій або вірусів. Чутливість ПЛР-аналізу складає 10-1000 клітин в пробі (чутливість імунологічних і мікроскопічних тестів - 103-105 клітин).
  • Універсальність процедури виявлення різних збудників полягає в тому, що матеріалом для дослідження методом ПЛР слугує ДНК або РНК збудника. Подібність хімічного складу всіх нуклеїнових кислот дозволяє застосовувати уніфіковані методи проведення лабораторних досліджень. Це дає можливість діагностувати кілька збудників з однієї біопроби.
  • Висока швидкість отримання результату аналізу обумовлена тим, що для проведення ПЛР-аналізу не потрібно виділення і вирощування культури збудника, що займає велику кількість часу.

Секвенування

Секвенування, секвенс (від англ. Sequence - послідовність) - визначення первинної амінокислотної або нуклеотидної послідовності біополімерів (білків і нуклеїнових кислот - ДНК і РНК). В результаті виходить лінійний символьний опис, який коротко пояснює структуру молекули. Для секвенування в даний час зазвичай застосовується метод Сенгера з дідезоксінуклеозідтріфосфатамі (ddNTP). Зазвичай до початку секвенування за допомогою ПЛР проводять ампліфікації ділянки ДНК, послідовність якої потрібно визначити.

Філогенетичний аналіз

Аналіз молекулярних даних є одним з підходів до теоретичного вивчення структури і функції генетичних макромолекул (РНК, ДНК, білків) і їх еволюційного перетворення. Основна мета філогенетичного аналізу - вивчення еволюційного порядку дивергенції послідовностей генів і білків або їх частин, а також відновлення списків еволюційних подій (замін нуклеотидів, делецій і вставок) в предкових лініях цих макромолекул.

Основним інструментом філогенетичного аналізу є порівняння близьких за структурою або по функції генів або білків, і перш за все, порівняння їх первинних послідовностей. Найважливішою властивістю функціонально значущих структур макромолекул є їх еволюційний консерватизм. Чим менше функціональна важливість окремих ділянок генів, тим більше вони мають тенденцію до еволюційної мінливості.

Додайте перший відгук
Новий відгук або коментар
Увійти за допомогою
Оцініть товар
Надіслати
Ціну уточнюйте

Для отримання консультації Ви можете звернутися до менеджера по темі, що Вас цікавить:

Обладнання для свинарства:

 050-414-11-22 Людмила Гапоненко

 068-454-11-22 Леся Слободянюк

 098-454-11-22

 050-454-11-22

Обладнання для скотарства:

 050-412-10-10 Ярослав Клименко

 050-426-45-45 Тетяна Васюк

 096-426-45-45 Наталія Свінціцька

Лабораторне обладнання:

 050-330-40-50

Діагностичне обладнання:

 097-430-40-50

  • Самовивіз
  • Новою Поштою по Україні
  • Кур'єром Нової Пошти
  • Безготівковий розрахунок
Характеристики
Назва Молекулярно-генетичні методи досліджень
Артикул 0214-0245
Вгору