Молекулярно-генетические методы исследования

Молекулярно-генетические методы исследования

Компания Укрвет проводит молекулярно-генетические исследования следующими методами:

• Полимеразная цепная реакция (ПЦР, PCR).
• Секвенирование ДНК.
• Филогенетический анализ.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Метод основан на многократном избирательном копировании определенного участка ДНК с помощью ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируют относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований.

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который нужно амплифицировать.
• Праймеры ― короткие синтетические олигонуклеотиды длиной 18-30 оснований, комплементарные на противоположных концах разных цепей необходимого фрагмента ДНК.
• Термостабильная ДНК-полимераза ― фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов ― Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
• Дезоксирибонуклеозидтрифосфатив (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции.
• Реакция проводится в 30-50 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий: денатурация, отжиг, элонгация.

ПЦР в режиме реального времени (real-time PCR):

Real-time PCR это группа методик, дающих возможность анализа продуктов ПЦР в режиме реального времени по ходу проведения реакции.

Основными этапами данного метода являются:

• Определение выхода продукта реакции после каждого цикла амплификации.
• Построение по этим данным кинетической кривой PCR.

Определение относительной концентрации субстрата на основании анализа этой кривой:

Для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта. Механизмы ее генерации различаются в зависимости от конкретного типа real-time PCR.

Кинетическая кривая PCR имеет S-образную форму.

В ней можно выделить три стадии:

• Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой).
• Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR).
• Плато (стадию насыщения).

Исходное количество субстрата определяется порогом цикла (threshold cycle), такой цикл n, на котором достигается определенный заданный уровень флуоресценции ― пороговая флуоресценция при условии, что эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций.

Варианты real-time PCR различаются по способам генерации флуоресценции. Два основных используемых в настоящее время способа ― это:

• Применение интерколируючих флуоресцентных агентов, флуоресценция которых значительно возрастает при связывании с двухцепочной ДНК,
• Использование меченых флуоресцентными агентами олигонуклеотидных проб, комплементарных области PCR-продукта.

Преимущества метода ПЦР, как метода диагностики инфекционных заболеваний:

• Обнаружение ДНК возбудителя методом ПЦР дает прямое указание на присутствие возбудителя инфекции.
• Высокая специфичность метода ПЦР обусловлена тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный, характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК, исключает возможность получения ложных результатов, в отличие от метода иммуноферментного анализа, где нередки ошибки в связи с перекрестно-реагирующих антигенами.
• Метод ПЦР, благодаря высокой чувствительности, позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. Чувствительность ПЦР-анализа составляет 10-1000 клеток в пробе (чувствительность иммунологических и микроскопических тестов ― 103-105 клеток).
• Универсальность процедуры выявления различных возбудителей заключается в том, что материалом для исследования методом ПЦР служит ДНК или РНК возбудителя. Сходство химического состава всех нуклеиновых кислот позволяет применять унифицированные методы проведения лабораторных исследований. Это дает возможность диагностировать несколько возбудителей из одной биопробы.
• Высокая скорость получения результата анализа обусловлена тем, что для проведения ПЦР-анализа не требуется выделение и выращивание культуры возбудителя, занимает большое количество времени.

Секвенирование

Секвенирование, секвенс (от англ. Sequence ― последовательность) ― определение первичной аминокислотной или нуклеотидной последовательности биополимеров (белков и нуклеиновых кислот ― ДНК и РНК). В результате получается линейное символьное описание, которое кратко объясняет структуру молекулы. Для секвенирования в настоящее время обычно применяется метод Сэнгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно к началу секвенирования с помощью ПЦР производят амплификации участка ДНК, последовательность которого нужно определить.

Филогенетический анализ

Анализ молекулярных данных является одним из подходов к теоретическому изучению структуры и функции генетических макромолекул (РНК, ДНК, белков) и их эволюционного преобразования. Основная цель филогенетического анализа ― изучение эволюционного порядка дивергенции последовательностей генов и белков или их частей, а также восстановление списков эволюционных событий (замен нуклеотидов, делеций и вставок) в предковых линиях этих макромолекул.

Основным инструментом филогенетического анализа является сравнение близких по структуре или по функции генов или белков, и прежде всего, сравнение их первичных последовательностей. Важнейшим свойством функционально значимых структур макромолекул является их эволюционный консерватизм. Чем меньше функциональная важность отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости.